晶体结构揭示2，4-二乙酰基水解酶PhlG的活性机理

荧光假单胞杆菌菌株Pf-5可以产生一系列具有抗生素活性的次生代谢产物，因此作为一种有益菌被广泛应用于防治微生物引起的植物根部的病害。由荧光假单胞杆菌产生的2,4-二乙酰基间苯酚（DAPG）是一种广谱的抗生素，可以有效杀灭细菌、真菌和线虫，在高剂量下甚至对植物也有杀伤作用。而在荧光假单胞杆菌的胞内，需要有一种DAPG的浓度调节机制，防止过高浓度的DAPG对其自身产生杀伤作用。编码碳—碳键水解酶的基因PhlG与DAPG合成相关基因位于同一个操纵子的调控下，通过水解DAPG的苯环结构上的一个乙酰基，将DAPG转变成低毒性的单乙酰基间苯酚（MAPG），起到了调节胞内的DAPG浓度的作用。

中国科大的结构生物化学研究组用多波长反常散射法（MAD）解析了PhlG的2.0 Å的晶体结构。晶体结构显示，PhlG以二体形式存在，单体是由较小的一个N端二体化结构域和一个C端的所谓的Bet v1-like fold组成。PhlG的这种折叠类型，有别于以往发现的经典α/β-fold碳—碳键水解酶的结构。通过结构分析发现，在PhlG内部有一个狭小的口袋，同时分布着疏水残基和极性残基，以及一个五配位的金属离子。X射线反常信号的傅立叶分析表明该金属离子为锌离子。突变及活性分析显示，与锌离子配位的残基突变会导致PhlG的kcat/Km下降约5个数量级，提示与锌络合的水分子很可能在催化过程中参与了亲核攻击用。对底物DAPG与PhlG的结构进行分子对接确定了参与稳定底物的关键残基，进一步通过突变和活性分析确证了该酶与底物复合物模型的合理性。

图1.（左）反常信号差值傅立叶图以及电感耦合等离子体质谱证实，在被His129、Glu160、His270、Glu274和一个水分子Wat1络合的金属离子为Zn离子。红色的密度为反常散射信号的差值傅立叶图，该图是用在波长为0.9250 Å收集的数据计算的，等高线的水平为5σ。从图中可以看出，金属原子的反常散射的差值傅立叶图和硒代甲硫氨酸中硒原子的反常散射信号相当。而在这一波长下，锌离子的反常散射信号f” = 2.24，而其他一些金属原子如镁，钙的反常散射信号较弱（Mg的f” = 0.06, Ca的f” = 0.52）。 这就排除了这两种金属离子。进一步用电感耦合等离子体质谱法测定出锌离子和蛋白质的摩尔比是1.15:1，同时排除了Fe，Cu，Ni等金属离子。（右）用分子对接的方法得到的DAPG的反应中间产物结合到PhlG的活性中心的模型，图中的虚线表示形成的氢键。

该研究揭示了PhlG是一类锌离子依赖性的碳—碳键水解酶，并且确定了锌离子附近参与催化反应的关键残基，加深了我们对碳—碳键水解酶这种自然界中并不常见的水解酶类的催化机理的认识，相关成果于2010年2月12日发表在了《Journal of Biological Chemistry》上。在该研究中，北京同步辐射光源所提供的不同波长的光束线为确定该结构的相位和分析蛋白中结合的金属离子的成分提供了非常重要的实验支持。

发表文章：

Yong-Xing He1,#, Liang Huang1,#, Yanyan Xue1,#, Xue Fei1, Yan-Bin Teng1, Sheryl B. Rubin-Pitel2, Huimin Zhao2, and Cong-Zhao Zhou1. Crystal structure and computational analyses provide insights into the catalytic mechanism of 2, 4-diacetylphloroglucinol hydrolase PhlG from Pseudomonas fluorescens. J. Biol. Chem. (2010) 285(7):4603-11

1Hefei National Laboratory for Physical Sciences at Microscale and School of Life Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei, Anhui 230026, People’s Republic of China1;

2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Chemistry, and Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801;

#These authors contributed equally to this work.

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